免疫印迹（WB）：从电泳分离到条带定量的关键环节
变性电泳的分离原理、转膜效率的判断方法、封闭与抗体孵育条件，以及定量时为什么必须回到内参与线性范围。
免疫印迹的价值在于把「按分子量分离」与「按抗原识别」两件事叠加：凝胶电泳先按大小把复杂裂解液摊开，抗体再从中挑出目标蛋白。任何一步失准，最终看到的条带都不再能代表样品中的真实含量。
一、为什么必须先变性再分离
天然状态下的蛋白折叠形状各异，迁移率与分子量不成比例。加入阴离子表面活性剂并加热后，蛋白被展开并带上均匀的负电荷，迁移率才近似只与链长相关。这一步的彻底程度直接决定条带是否锐利：加热不足会留下部分折叠的构象，出现弥散或双条带；加热过度则可能造成聚集和降解。
二、转膜：效率比时间更重要
转膜是把凝胶中的蛋白转移到膜上，靠的是电场驱动的横向迁移。判断转膜是否完成，不能只看时间：大分子蛋白迁移慢，长时间转膜又会把已经上膜的小分子穿透过去。更可靠的做法是转膜后用可逆染料对膜染色，确认各泳道都留下了均匀的蛋白痕迹；同时把凝胶再染一次，检查有没有残留，两头对照才能定位问题。缓冲液中的甲醇比例会影响大分子从凝胶中的洗脱，调整这一步往往比延长转膜时间更有效。
三、
十二烷基硫酸钠 · CAS 151-21-3
阴离子表面活性剂是这套流程的核心试剂：它一方面把蛋白变性展开，另一方面提供均匀的负电荷，使分离只取决于分子量。它的纯度对流式的影响常被低估——含长链同系物的批次会在低分子量区出现额外背景。使用中要注意它对蛋白构象的破坏是不可逆的，因此涉及活性回收的实验不能使用；而配制成溶液后容易析出，需要在室温保存并避免冷藏结晶。
四、封闭与抗体孵育
封闭的目的是把膜上未被蛋白占满的位置堵住，降低抗体非特异吸附。封闭剂选择要看检测体系：以糖蛋白为封闭成分的试剂会与某些糖结合抗体交叉反应，若目标蛋白本身带糖链，就要改用非蛋白类封闭剂。抗体浓度宜按供应商建议先做梯度稀释，把「信噪比最高」而不是「条带最深」作为判断标准。洗液中加入温和的表面活性剂能降低背景，但浓度过高会把特异性结合也洗掉。
五、定量时必须回到内参与线性范围
条带深浅受上样量、转膜效率、显色时间共同影响，因此跨样品比较必须同时跑内参蛋白，用目标蛋白与内参的比值消除上样差异。另一个常被忽略的前提是线性：胶片与成像系统的响应在高强度区会饱和，若目标条带已经接近饱和，稀释样品或缩短曝光时间才可能落在可用区间。缺少这两步时，结论只能停留在「有无」，不能称为定量。
文中重点试剂结构式 · 点击查看规格与价格
相关产品推荐正在从站内商品库匹配…
同一产品线更多文章
本文由本站编辑基于公开技术资料独立撰写，观点与表述仅代表本站；如需转载请与我们联系。文中产品参数、包装规格与价格以商品详情页为准，图片中的分子结构式由本站结构库按 CAS 生成，仅供识别参考。
