蛋白质印迹（Western Blot）详解与试剂
从样品制备到显色的完整流程，关键试剂（SDS、甘氨酸、甲醇）的作用，以及常见失败原因排查。
Western Blot 是蛋白研究的"基本功"，也是最容易做糊的基本功。它由电泳分离、转膜、抗体识别、显色成像四步构成，每一步都藏着让结果"跑歪"的小机关。与其背方案，不如理解每一步试剂到底在做什么。
一、四步流程与试剂角色
| 步骤 | 关键试剂 | 作用 |
|---|---|---|
| 电泳（SDS-PAGE） | 十二烷基硫酸钠（151-21-3）、甘氨酸（56-40-6） | SDS 使蛋白带负电按分子量迁移；甘氨酸构成 Tris-甘氨酸电泳缓冲体系 |
| 转膜 | 甲醇、Tris/甘氨酸转膜液 | 甲醇促进蛋白与膜结合，但会缩小凝胶孔径 |
| 封闭 | 脱脂奶粉 / BSA | 占据非特异位点，降低背景 |
| 识别与显色 | 一抗/二抗、ECL 底物 | 辣根过氧化物酶催化发光，曝光定量 |
二、操作要点
- 上样量与对照：每孔 10–30 μg 总蛋白较稳妥；内参（β-actin、GAPDH）与目标蛋白分子量要错开。
- 变性条件：常规 95 ℃ 5 min；膜蛋白与多聚体蛋白建议 70 ℃ 10 min 避免聚集。
- 转膜效率：高分子量蛋白需降低甲醇浓度、延长时间并加 SDS；小分子蛋白则相反，防止穿透膜。
- 抗体孵育：一抗 4 ℃ 过夜提高特异性；洗膜不充分是高背景最常见的原因。
三、常见失败与排查
- 没有条带？按顺序排查：蛋白上样量 → 转膜效率（丽春红染色） → 抗体有效性 → 显色底物活性。
- 背景高？封闭不充分、抗体浓度过高或洗膜不足，逐一收紧。
- 条带拖尾或弯曲？盐浓度过高、样品过载或电泳过热，优化上样与电泳条件。
- 多带？考虑降解（加蛋白酶抑制剂）、异构体或非特异结合（换抗体或提高洗膜强度）。
四、定量与重复性
- 线性范围：化学发光信号饱和很快，建议做上样量梯度确认线性区间再定量。
- 重复性：同一样品分装避免反复冻融，抗体批次固定可显著减少波动。
- 内参选择：不同组织与处理条件下内参表达会变，必要时使用总蛋白归一化。
五、采购建议
Western Blot 试剂多为常规品种，但 SDS、甘氨酸等基础试剂的纯度直接影响电泳质量，建议固定批号。本站生命科学与分析化学产品线提供十二烷基硫酸钠、甘氨酸等 WB 核心试剂，规格在详情页可查；如需预制缓冲液或配套显色体系，可通过定制合成服务沟通。
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