外泌体试剂：分离与鉴定要点
外泌体的超速离心与聚合物沉淀等分离方法对比、标志物鉴定体系，以及样品前处理的注意事项。
外泌体是细胞分泌的 30–150 nm 级细胞外囊泡，携带母源细胞的蛋白、RNA 与脂质，近年来在液体活检与药物递送领域热度极高。但外泌体研究最现实的门槛是：怎么把这么小的囊泡从复杂体液里干净地拿出来，并且证明"拿到的就是它"。
一、主流分离方法
| 方法 | 原理 | 优点 | 局限 |
|---|---|---|---|
| 差速+蔗糖密度梯度超速离心 | 按浮力密度分离（蔗糖 57-50-1 常配密度梯度介质） | 纯度高，金标准 | 耗时长、需要超速离心机 |
| 聚合物沉淀 | 降低溶解度使囊泡析出 | 操作简单、通量高 | 共沉淀蛋白多，纯度一般 |
| 尺寸排阻色谱 | 按流体力学体积分离 | 保持囊泡完整 | 载量低、稀释样品 |
| 免疫亲和捕获 | CD9/CD63/CD81 抗体磁珠 | 特异性高 | 成本高、可能损伤囊泡 |
二、鉴定：不是单一指标
国际细胞外囊泡学会（ISEV）明确要求用多维度证据描述囊泡制备物，而非单一标志物：
- 膜标志蛋白：CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix 富集；同时阴性对照（Calnexin 等内质网蛋白）应为阴性。
- 颗粒计数与粒径：NTA（纳米颗粒跟踪分析）或 TRPS，报告浓度与粒径分布。
- 形态：透射电镜确认典型碗状/球形形态。
- 纯度指标：颗粒/蛋白比值是判断污染程度的重要参考。
三、样品前处理要点
- 培养基选择：胎牛血清自带大量牛源外泌体，细胞培养应使用去外泌体血清。
- 预离心清除：先低速离心去除细胞与碎片，再 2000–10000 g 去除大囊泡，最后进入超速离心。
- 避免反复冻融：囊泡对冻融敏感，分装保存于 -80 ℃，可加入少量还原剂（如 DTT 3483-12-3 处理裂解样品）以减少蛋白聚集干扰下游分析。
- 缓冲液：PBS 过滤除菌后使用，避免脂蛋白与聚合物污染。
四、常见问题
- NTA 浓度异常高？多为蛋白聚集体或脂蛋白污染，需提高纯化强度并核对颗粒/蛋白比。
- 标志物 Western 检测不到？上样量不足或样品被过度稀释，先定量总蛋白再统一上样。
- 批次差异大？固定细胞状态、培养时间与血清批次，是可重复性的前提。
五、采购建议
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