蛋白荧光染色：SYPRO Ruby、Deep Purple 与免染胶
2026-10-17 · 专业著作 · 百灵威授权转载
考马斯亮蓝染完一看，目标条带若有若无，是继续优化上样还是换一种染色？当样品量有限、条带又偏弱时，很多实验室会把目光转向荧光类方案。但荧光染料不止一种，免染胶又是另一条思路，它们各自解决什么问题、对设备和下游有什么要求，值得先理清楚再动手。
一、荧光染色在解决什么问题
信号来源不同：常规染料染色是“有蛋白就着色”，荧光染色是“有激发光才发光”，没有激发就没有背景，所以背景通常更干净。
定量更友好：荧光信号在较宽范围内随蛋白量变化，配合总蛋白归一化，做泳道间比较比肉眼看着色深浅可靠。
设备有门槛：需要能匹配染料激发与发射的成像系统，凝胶成像仪、激光扫描仪或带相应滤光片的 CCD 都可以，具体滤光片按染料说明书选。
操作有讲究：染料多数要避光保存，染色和洗涤过程也要避光；器皿要干净，残留的洗涤剂、还原剂都可能抬背景。
二、SYPRO Ruby 这类钌配合物染料
定位：属于凝胶内染色的终点法染料，染色完成后信号相对稳定，不必抢时间成像，适合批量处理和多块胶排队上机。
流程：一般先固定，再染色、洗涤，各步骤的时长和溶液组成以说明书为准；固定不充分时背景会偏高。
特点：背景低、对蛋白量的响应范围宽，常被用作总蛋白定量的参考方法之一。
注意：对糖蛋白等特殊修饰蛋白的响应可能偏弱，解读时要结合样品性质；固定会锁住蛋白，若后续还要转膜或回收活性，应提前安排顺序。
三、Deep Purple 这类荧光生成型染料
定位：染料未与蛋白结合时自身荧光很弱，结合之后才明显增强，因此可以把背景压得比较低，本质上也属于终点染色。
流程：通常需要固定，染色后短暂洗涤、适当干燥再成像，具体步骤按说明书执行。
常见搭配：在糖蛋白分析中，它常与特异性的糖基染色配合使用，同一块胶上分别看总蛋白和糖蛋白。
注意：染料对光敏感，全程避光；染色均匀性受固定和洗涤是否规范影响较大。
四、免染胶：不做染色的总蛋白
原理：凝胶聚合时掺入可反应的基团，电泳后经紫外激发，与蛋白中的色氨酸残基反应生成可检测信号，蛋白本身不需要额外染色。
优点：省去固定、染色、脱色，样品不损失、也不额外占用操作时间；在 Western blot 里常用作总蛋白归一化，避免反复洗脱再孵育内参。
局限：信号依赖色氨酸含量，含色氨酸少的蛋白响应偏弱，结果解读要谨慎；需要配套的成像设备和配套凝胶。
归一化用法：同一个泳道先看总蛋白、再走化学发光检测，用总蛋白信号做归一化，可以省去内参抗体和反复洗脱。
注意：紫外激发对眼睛和皮肤有风险，按仪器说明做好防护，不要直视光源。
五、小结
选择思路：先看有没有匹配的成像设备，再看下游是定量、质谱还是转膜，最后考虑样品类型和通量；几条路线各有侧重，不必互相替代。
一句话：荧光染色赢在低背景和定量，免染胶赢在省步骤，按设备与下游选。
记住：固定顺序先想清楚，全程避光、器皿干净，参数以说明书和当批 SDS/COA 为准。
一、荧光染色在解决什么问题
信号来源不同：常规染料染色是“有蛋白就着色”，荧光染色是“有激发光才发光”，没有激发就没有背景，所以背景通常更干净。
定量更友好：荧光信号在较宽范围内随蛋白量变化，配合总蛋白归一化，做泳道间比较比肉眼看着色深浅可靠。
设备有门槛：需要能匹配染料激发与发射的成像系统，凝胶成像仪、激光扫描仪或带相应滤光片的 CCD 都可以，具体滤光片按染料说明书选。
操作有讲究：染料多数要避光保存，染色和洗涤过程也要避光；器皿要干净，残留的洗涤剂、还原剂都可能抬背景。
二、SYPRO Ruby 这类钌配合物染料
定位：属于凝胶内染色的终点法染料，染色完成后信号相对稳定，不必抢时间成像，适合批量处理和多块胶排队上机。
流程：一般先固定，再染色、洗涤，各步骤的时长和溶液组成以说明书为准；固定不充分时背景会偏高。
特点：背景低、对蛋白量的响应范围宽，常被用作总蛋白定量的参考方法之一。
注意：对糖蛋白等特殊修饰蛋白的响应可能偏弱，解读时要结合样品性质；固定会锁住蛋白，若后续还要转膜或回收活性，应提前安排顺序。
三、Deep Purple 这类荧光生成型染料
定位：染料未与蛋白结合时自身荧光很弱，结合之后才明显增强，因此可以把背景压得比较低，本质上也属于终点染色。
流程：通常需要固定，染色后短暂洗涤、适当干燥再成像，具体步骤按说明书执行。
常见搭配：在糖蛋白分析中，它常与特异性的糖基染色配合使用，同一块胶上分别看总蛋白和糖蛋白。
注意：染料对光敏感，全程避光；染色均匀性受固定和洗涤是否规范影响较大。
四、免染胶：不做染色的总蛋白
原理：凝胶聚合时掺入可反应的基团，电泳后经紫外激发，与蛋白中的色氨酸残基反应生成可检测信号，蛋白本身不需要额外染色。
优点：省去固定、染色、脱色，样品不损失、也不额外占用操作时间；在 Western blot 里常用作总蛋白归一化，避免反复洗脱再孵育内参。
局限：信号依赖色氨酸含量，含色氨酸少的蛋白响应偏弱，结果解读要谨慎；需要配套的成像设备和配套凝胶。
归一化用法：同一个泳道先看总蛋白、再走化学发光检测，用总蛋白信号做归一化，可以省去内参抗体和反复洗脱。
注意：紫外激发对眼睛和皮肤有风险，按仪器说明做好防护，不要直视光源。
五、小结
选择思路：先看有没有匹配的成像设备，再看下游是定量、质谱还是转膜，最后考虑样品类型和通量；几条路线各有侧重，不必互相替代。
一句话：荧光染色赢在低背景和定量，免染胶赢在省步骤，按设备与下游选。
记住：固定顺序先想清楚，全程避光、器皿干净，参数以说明书和当批 SDS/COA 为准。
