Western Blot 全流程关键试剂：SDS、Tris、甘氨酸、APS、TEMED
2026-10-08 · 专业著作 · 百灵威授权转载
Western Blot 的结果是否清晰，很大程度上取决于几种基础试剂是否用对。SDS、Tris、甘氨酸、过硫酸铵和 TEMED 贯穿制胶、电泳与转膜三个环节，各自承担不同角色又彼此配合。理解这些角色，遇到条带异常或凝胶不凝时才有判断依据。
一、SDS：变性与赋电
SDS 是阴离子表面活性剂，在水中形成带负电的胶束。它与蛋白质结合后使多肽链伸展，破坏高级结构，并让复合物带上与分子量大致成比例的负电荷。经过加热和还原剂处理后，蛋白质自身电荷差异被掩盖，迁移率主要由分子量决定，这就是 SDS-PAGE 能按大小分离的基础。SDS 同时存在于凝胶和电泳缓冲液中，浓度不足会导致条带拖尾或分辨率下降。SDS 粉尘对皮肤、眼睛和呼吸道有刺激性，称量溶解宜通风并做好防护，具体要求请核对当批次试剂说明与实验室制度。
二、Tris：缓冲体系的主体
Tris 是贯穿全流程的缓冲成分，其缓冲范围与常见电泳和转膜条件匹配。制胶时用 Tris 配制分离胶与浓缩胶缓冲液，两者 pH 不同，配合甘氨酸形成不连续缓冲体系；电泳和转膜缓冲液同样以 Tris 为基础。Tris 的 pH 对温度敏感，温度升高时 pH 会下降，因此配制和调 pH 应尽量在接近使用温度下进行，并在同一批实验中保持一致。
三、甘氨酸：拖尾离子与转膜载体
电泳缓冲液中，甘氨酸以两性离子形式存在，作为拖尾离子与氯离子、Tris 共同构成不连续缓冲体系。样品在浓缩胶中被压缩成极窄起始带，进入分离胶后才按分子量展开，从而获得锐利条带，这正是甘氨酸参与的结果。转膜缓冲液中，甘氨酸作为载体离子参与电流传导，帮助蛋白质从凝胶向膜上迁移。转膜缓冲液通常还加入甲醇，其比例会影响洗脱效率与大分子量的转移。
四、APS 与 TEMED：聚合引发体系
过硫酸铵是自由基引发剂，在水溶液中分解产生自由基，引发丙烯酰胺与双丙烯酰胺的链式聚合交联。TEMED 是叔胺类化合物，起催化作用，加速过硫酸铵分解并促进自由基生成，二者共同构成凝胶聚合的引发体系。APS 易吸潮并逐渐失效，宜现配或分装冻存；聚合速度受 APS 与 TEMED 用量、温度和氧气影响，室温偏低时可适当增量，但过量会让凝胶变脆或聚合过快。TEMED 有挥发性且气味明显，应通风操作并密封保存。
五、聚合问题排查与试剂保存
凝胶不凝常见于 APS 失效、TEMED 不足或温度过低，可先换新配 APS 再排查；聚合过快往往与引发剂过量有关，会造成局部不均匀与条带畸变。条带拖尾或分辨率下降可能与 SDS 浓度、缓冲液 pH 偏差、电压过高或凝胶未完全聚合有关；转膜效率低则常与甲醇比例、电流时间及膜胶间气泡相关。保存上，Tris 和甘氨酸应密封防潮，SDS 溶液久置可能析出，APS 宜少量分装并避免反复开盖，TEMED 需避光密封并远离酸类。丙烯酰胺单体具有神经毒性，建议使用商品化预制溶液以减少称量，防护请以当批次试剂信息和实验室制度为准。
把这几种试剂的作用理顺，就能把制胶、电泳和转膜中的多数异常归因到具体环节。配液记录完整、试剂状态清楚、参数稳定，是让 Western Blot 结果可重复的基础。
一、SDS：变性与赋电
SDS 是阴离子表面活性剂，在水中形成带负电的胶束。它与蛋白质结合后使多肽链伸展，破坏高级结构，并让复合物带上与分子量大致成比例的负电荷。经过加热和还原剂处理后，蛋白质自身电荷差异被掩盖，迁移率主要由分子量决定，这就是 SDS-PAGE 能按大小分离的基础。SDS 同时存在于凝胶和电泳缓冲液中，浓度不足会导致条带拖尾或分辨率下降。SDS 粉尘对皮肤、眼睛和呼吸道有刺激性，称量溶解宜通风并做好防护，具体要求请核对当批次试剂说明与实验室制度。
二、Tris：缓冲体系的主体
Tris 是贯穿全流程的缓冲成分，其缓冲范围与常见电泳和转膜条件匹配。制胶时用 Tris 配制分离胶与浓缩胶缓冲液，两者 pH 不同，配合甘氨酸形成不连续缓冲体系；电泳和转膜缓冲液同样以 Tris 为基础。Tris 的 pH 对温度敏感，温度升高时 pH 会下降，因此配制和调 pH 应尽量在接近使用温度下进行，并在同一批实验中保持一致。
三、甘氨酸：拖尾离子与转膜载体
电泳缓冲液中，甘氨酸以两性离子形式存在，作为拖尾离子与氯离子、Tris 共同构成不连续缓冲体系。样品在浓缩胶中被压缩成极窄起始带，进入分离胶后才按分子量展开，从而获得锐利条带，这正是甘氨酸参与的结果。转膜缓冲液中，甘氨酸作为载体离子参与电流传导，帮助蛋白质从凝胶向膜上迁移。转膜缓冲液通常还加入甲醇，其比例会影响洗脱效率与大分子量的转移。
四、APS 与 TEMED：聚合引发体系
过硫酸铵是自由基引发剂，在水溶液中分解产生自由基，引发丙烯酰胺与双丙烯酰胺的链式聚合交联。TEMED 是叔胺类化合物，起催化作用，加速过硫酸铵分解并促进自由基生成，二者共同构成凝胶聚合的引发体系。APS 易吸潮并逐渐失效，宜现配或分装冻存；聚合速度受 APS 与 TEMED 用量、温度和氧气影响，室温偏低时可适当增量，但过量会让凝胶变脆或聚合过快。TEMED 有挥发性且气味明显，应通风操作并密封保存。
五、聚合问题排查与试剂保存
凝胶不凝常见于 APS 失效、TEMED 不足或温度过低，可先换新配 APS 再排查；聚合过快往往与引发剂过量有关，会造成局部不均匀与条带畸变。条带拖尾或分辨率下降可能与 SDS 浓度、缓冲液 pH 偏差、电压过高或凝胶未完全聚合有关；转膜效率低则常与甲醇比例、电流时间及膜胶间气泡相关。保存上，Tris 和甘氨酸应密封防潮，SDS 溶液久置可能析出，APS 宜少量分装并避免反复开盖，TEMED 需避光密封并远离酸类。丙烯酰胺单体具有神经毒性，建议使用商品化预制溶液以减少称量，防护请以当批次试剂信息和实验室制度为准。
把这几种试剂的作用理顺，就能把制胶、电泳和转膜中的多数异常归因到具体环节。配液记录完整、试剂状态清楚、参数稳定，是让 Western Blot 结果可重复的基础。
