琼脂糖凝胶电泳的原理与操作要点
2026-09-17 · 趣味化学 · 百灵威授权转载
分子克隆里最日常的操作之一，就是跑胶。琼脂糖凝胶电泳的原理是什么？操作要点有哪些？这篇文章一次讲清。
一、电泳的原理
核酸分子的磷酸骨架带负电荷，放在电场里会向正极迁移。
琼脂糖凝胶是网状结构，像筛子一样：片段大的跑得慢，片段小的跑得快，不同大小的DNA就被分开了。
条带的位置和分子量大小有关，配合DNAmarker可以判断片段大小。
二、影响迁移率的因素
分子量：片段越大迁移越慢，迁移率与分子量对数大致成反比。
凝胶浓度：浓度越高孔径越小，大片段跑不动，适合小片段分离。
构象：同一DNA不同构象迁移速度不同，超螺旋最快，开环最慢。
电压与温度：电压过高发热，条带模糊，要控电压。
三、配胶
称胶：按片段大小选浓度，常规用0。8%到1%，大片段用低浓度，小片段用高浓度。
溶解：琼脂糖加到缓冲液中加热煮沸，完全透明才算溶解好。
降温加染料：冷却到约50到60摄氏度，加核酸染料，混匀倒板。
插梳子：梳子离底板留出厚度，凝固后再拔。
四、上样与电泳
上样缓冲液：样品加上样缓冲液（含甘油和指示剂），沉入孔底并指示迁移。
加marker：至少一孔加DNAmarker，用于判断大小。
缓冲液淹没：电泳槽加TAE或TBE，液面没过凝胶。
电压控制：一般每厘米1到5伏，过高会发热、条带变形。
五、染色与观察
染色：凝胶跑完用核酸染料染色，或用含染料的胶直接跑。
观察：紫外灯或蓝光仪下看条带，拍照记录。
安全：紫外对眼睛和皮肤有伤害，操作戴护目镜、用面罩，含EB的胶按规范处理。
六、常见问题排查
条带模糊：电压过高、胶浓度不合适或样品降解，降低电压、调整浓度、检查样品。
拖尾：样品降解或上样量过大，减少上样量，重新提取样品。
跑不动：电压太低或胶浓度太高，提高电压、降低浓度。
条带弯曲：上样量过大或胶孔变形，减少上样量、插好梳子。
七、常见问题
问：琼脂糖凝胶电泳的原理是什么？
答：DNA带负电荷在电场中向正极迁移，凝胶的网状结构起分子筛作用，大片段慢、小片段快，按分子量分开。
问：凝胶浓度怎么选？
答：常规0。8%到1%，大片段用低浓度（如0。7%），小片段用高浓度（如2%），按目标片段大小选。
问：电泳电压设多少？
答：一般每厘米1到5伏，按凝胶长度算，电压过高会发热导致条带模糊。
问：条带拖尾是什么原因？
答：常见是样品降解、上样量过大或蛋白污染，减少上样量、检查样品质量。
问：EB染料安全吗？
答：EB有致突变风险，操作戴手套，避免接触，废胶废液按规范处理，可改用更安全的荧光染料。
问：跑完的胶能再跑吗？
答：不建议。胶已经变性或染色，重新电泳条带不清晰，重新配胶跑。
八、总结
琼脂糖凝胶电泳的原理，一句话：带负电的核酸向阳极跑，凝胶筛子按大小分。操作记住：浓度配胶、电压控制、marker对照。跑胶跑得好，克隆看得清。
一、电泳的原理
核酸分子的磷酸骨架带负电荷，放在电场里会向正极迁移。
琼脂糖凝胶是网状结构，像筛子一样：片段大的跑得慢，片段小的跑得快，不同大小的DNA就被分开了。
条带的位置和分子量大小有关，配合DNAmarker可以判断片段大小。
二、影响迁移率的因素
分子量：片段越大迁移越慢，迁移率与分子量对数大致成反比。
凝胶浓度：浓度越高孔径越小，大片段跑不动，适合小片段分离。
构象：同一DNA不同构象迁移速度不同，超螺旋最快，开环最慢。
电压与温度：电压过高发热，条带模糊，要控电压。
三、配胶
称胶：按片段大小选浓度，常规用0。8%到1%，大片段用低浓度，小片段用高浓度。
溶解：琼脂糖加到缓冲液中加热煮沸，完全透明才算溶解好。
降温加染料：冷却到约50到60摄氏度，加核酸染料，混匀倒板。
插梳子：梳子离底板留出厚度，凝固后再拔。
四、上样与电泳
上样缓冲液：样品加上样缓冲液（含甘油和指示剂），沉入孔底并指示迁移。
加marker：至少一孔加DNAmarker，用于判断大小。
缓冲液淹没：电泳槽加TAE或TBE，液面没过凝胶。
电压控制：一般每厘米1到5伏，过高会发热、条带变形。
五、染色与观察
染色：凝胶跑完用核酸染料染色，或用含染料的胶直接跑。
观察：紫外灯或蓝光仪下看条带，拍照记录。
安全：紫外对眼睛和皮肤有伤害，操作戴护目镜、用面罩，含EB的胶按规范处理。
六、常见问题排查
条带模糊：电压过高、胶浓度不合适或样品降解，降低电压、调整浓度、检查样品。
拖尾：样品降解或上样量过大，减少上样量，重新提取样品。
跑不动：电压太低或胶浓度太高，提高电压、降低浓度。
条带弯曲：上样量过大或胶孔变形，减少上样量、插好梳子。
七、常见问题
问：琼脂糖凝胶电泳的原理是什么？
答：DNA带负电荷在电场中向正极迁移，凝胶的网状结构起分子筛作用，大片段慢、小片段快，按分子量分开。
问：凝胶浓度怎么选？
答：常规0。8%到1%，大片段用低浓度（如0。7%），小片段用高浓度（如2%），按目标片段大小选。
问：电泳电压设多少？
答：一般每厘米1到5伏，按凝胶长度算，电压过高会发热导致条带模糊。
问：条带拖尾是什么原因？
答：常见是样品降解、上样量过大或蛋白污染，减少上样量、检查样品质量。
问：EB染料安全吗？
答：EB有致突变风险，操作戴手套，避免接触，废胶废液按规范处理，可改用更安全的荧光染料。
问：跑完的胶能再跑吗？
答：不建议。胶已经变性或染色，重新电泳条带不清晰，重新配胶跑。
八、总结
琼脂糖凝胶电泳的原理，一句话：带负电的核酸向阳极跑，凝胶筛子按大小分。操作记住：浓度配胶、电压控制、marker对照。跑胶跑得好，克隆看得清。
