柱层析分离装柱技巧
2026-07-25 · 实验技术 · 百灵威授权转载
一、填料前期预处理
- 硅胶 / 氧化铝填料选用对应规格，有机分离一般 200–300 目；
- 湿法专用：填料用起始洗脱溶剂充分浸泡搅拌，超声 30min 除去气泡，静置沉降，倒掉上层细粉（细粉会堵柱、流速极慢）；
- 氧化铝填料需提前活化；硅胶避免长时间接触水相，防止失活。
二、湿法装柱（实验室首选，分离效果均匀）
- 层析柱竖直固定，底部铺一层脱脂棉 / 石英砂，薄溶剂润湿，堵住底部漏料。
- 泡好的填料制成稀匀浆，一次性缓慢倒入柱内，全程保持液面高于填料，不能干柱。
- 打开下端活塞，低流速淋洗，填料依靠重力自然沉降；持续补充溶剂，保证沉降过程无裸露干层。
- 沉降完成后，用溶剂稳定冲洗 3–5 柱体积压实填料；观察柱层无气泡、无断层、无沟流。
- 柱顶预留 2–3cm 溶剂层，上层铺一层石英砂，防止上样时冲坏平整硅胶层。
三、干法装柱（适合低极性正相体系）
- 柱底垫棉花，倒入少量洗脱溶剂润湿；
- 干填料匀速缓慢倒入层析柱，边倒边轻敲柱壁，让填料均匀紧实，避免局部疏松；
- 加满填料后，从顶部缓慢加入起始洗脱溶剂，自上而下浸润填料，排尽内部空气；
- 持续淋洗压实，直至柱层高度不再下降，顶部铺石英砂保护层。
四、核心关键装柱技巧
-
杜绝气泡、断层
匀浆不能有气泡；装柱全程液面不能低于填料；敲打柱壁赶出夹层气泡；柱内出现气泡会造成样品走偏、分离度变差。
-
防止沟流
填料沉降速度均匀，不可快速大流量冲柱；填料松紧全程一致，一边松一边紧会形成沟流，组分共出。
-
填料高度把控
分离难度高、组分极性接近：填料高度 20–30cm；简单粗分 10–15cm 即可；柱径越大，高度适当增加。
-
压实程度
自然重力沉降最佳，禁止高压快速压实，填料过紧流速极慢；过松容易塌陷、分离差。
-
上下保护层
底部脱脂棉 / 石英砂防止漏粉；顶部石英砂避免上样溶液冲击破坏硅胶平面。
五、上样配套要求
- 样品尽量用最低极性溶剂溶解，少量上样；
- 样品溶液沿柱内壁缓慢加入，不要直冲硅胶层；
- 样品完全渗入填料后，再缓慢加洗脱溶剂，避免样品扩散加宽色带。
六、常见装柱失败问题与解决
- 柱内大量气泡：匀浆未超声脱气、装柱中途液面干过，重新装柱。
- 流速忽快忽慢、色带歪斜：填料松紧不均、沟流，重装。
- 底部漏硅胶：脱脂棉铺太薄、填料过细，加厚垫层。
- 色带严重拖尾、交叉：填料沉降不平整、顶部硅胶被冲散，加装石英砂保护层。
七、正反相柱装柱小区别
- 正相（硅胶、氧化铝）：石油醚、二氯甲烷等弱极性溶剂匀浆装柱；
- 反相 C18 硅胶柱：甲醇 / 乙腈做匀浆溶剂，禁止纯正己烷；
- HILIC 亲水填料必须高有机相保存，不可纯水装柱浸泡。
八、禁忌操作
- 填料一次性快速倒入，大量气泡包裹在柱内；
- 装柱过程放空溶剂，填料干涸开裂；
- 高压快速冲洗压实填料，柱压过高；
- 不铺顶部石英砂，上样直接冲坏平整硅胶层；
- 新旧填料混合装填，粒度不均分离失效。
