细胞培养无菌操作规范
2026-07-25 · 实验技术 · 百灵威授权转载
一、实验前环境与人员准备
1. 环境消杀
- 超净台：提前 30min 开启紫外灯照射消毒；开机吹风 10min 排尽臭氧后再操作；台面用 75% 乙醇全面擦拭，包含侧壁、支架、移液器外壁。
- 细胞房：每日紫外消毒 30min；地面、传递窗用季铵盐消毒液擦拭；禁止存放食物、水杯、私人物品。
- 配套设备：CO₂培养箱每周擦拭内胆，水盘添加无菌去离子水 + 抑菌剂；离心机、水浴锅定期消毒。
2. 人员无菌着装与手部规范
- 更换专用细胞房无尘服、一次性无菌鞋套、口罩、无菌手套，头发全部包裹。
- 手部：流水洗手，75% 乙醇喷洒手套双手揉搓晾干；手套破损、触碰外部物品必须立即更换。
- 禁止：佩戴首饰、涂抹护肤品、操作时摸脸、倚靠超净台外壁。
二、物品进出超净台规则
- 所有耗材（培养瓶、移液管、枪头、离心管）提前灭菌；未灭菌物品严禁带入。
- 外部试剂、培养基瓶外壁喷洒 75% 乙醇，静置 30s 后再放入操作台内。
- 操作台内物品分区摆放，近风口放干净耗材，操作区居中，废液缸远离风道口；物品不遮挡回风滤网。
- 一次性耗材只拆内侧包装，外包装留在操作台外。
三、超净台内核心无菌操作要点
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气流保护
所有操作在超净台中后部进行，手臂不可越过敞开容器瓶口；瓶口避开风口直吹。
- 容器开盖规范
- 培养瓶、离心管瓶盖倒置放置，开口朝下；禁止瓶口朝上暴露空气。
- 开盖操作快速，不用时立刻盖紧，长时间敞口极易污染。
- 倾倒液体时瓶口不要触碰废液缸、管壁。
- 移液操作
- 一次性移液管、枪头只用一次，严禁反复浸入培养基、细胞悬液。
- 吸液、吹打轻柔，避免产生气溶胶飞溅造成交叉污染。
- 不同细胞株、不同培养基更换移液耗材，禁止共用。
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试剂取用
培养基、胰酶、PBS 避免长时间敞口；倾倒剩余液体不回倒原瓶，防止整瓶污染。
四、细胞传代、换液标准无菌流程
- 取出培养瓶，75% 乙醇擦拭外壁后移入超净台。
- 弃旧培养基，无菌 PBS 轻柔清洗细胞单层 1～2 次，去除残留血清、代谢废物。
- 加入胰酶消化，消化结束及时加完全培养基终止消化。
- 吹打细胞制成均匀悬液，分装至新无菌培养瓶，标注细胞名称、传代日期、代次。
- 培养瓶外壁喷洒酒精，平稳移入 CO₂培养箱，轻放不堆叠。
五、污染防控关键操作
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区分废液容器
细胞废液单独收集，含细胞、胰酶、抗生素废液，先加 84 消毒液灭活 30min 后再倾倒，不可直接下水道排放。
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避免交叉污染
不同细胞株分开操作，做完一株彻底更换枪头、擦拭台面后再处理下一株；耗材不混用。
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抗生素使用规则
常规培养尽量少用双抗，仅复苏、污染风险高时添加；长期依赖抗生素会掩盖轻度支原体污染。
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支原体防控
定期支原体检测；血清、培养基从正规无菌级厂家采购；耗材无热源无支原体。
六、操作结束收尾工作
- 清理台面废弃物，一次性耗材密封丢弃生物危险垃圾桶。
- 台面、移液器、支架用 75% 乙醇完整擦拭。
- 关闭紫外、风机；超净台通风 3min 后关机。
- 水浴锅、离心机擦拭残留液体，保持干燥洁净。
七、严格禁止行为
- 在超净台饮食、喝水、写字、玩手机；
- 徒手触碰培养瓶瓶口、耗材无菌端；
- 敞开培养箱门长时间挑选细胞，箱内空气杂菌沉降污染；
- 废液、枪头随意丢弃，气溶胶扩散污染环境；
- 过期培养基、变色浑浊培养液继续使用；
- 非无菌试剂、普通实验试剂带入细胞房。
八、异常情况处理
- 液体溅落台面：立即用 75% 乙醇覆盖浸泡 10min 后擦拭。
- 手套触碰非无菌区域：立刻更换新手套，重新酒精消毒双手。
- 细胞出现浑浊、飘菌、菌丝：整瓶密封，消毒液灭活后丢弃，操作台加强紫外消毒。
