干货满满！生物样品前处理方法详解
2024-09-29 · 实验技术 · 百灵威授权转载
生物样品前处理是生物实验和分析过程中的一个重要步骤，涉及到从生物体或者环境中提取、纯化、浓集目标分析物，以便于后续分析检测。其难点在于如何高效、准确地从复杂的样品基质中提取和纯化低浓度目标分析物，同时保持方法稳定性和重复性。
样品采集
全血
包括液体成分的血浆和分散悬浮于其中的血细胞。
全血不易保存，且血细胞中含有很多干扰物质，仅用于血浆药物浓度太低或血浆药物浓度波动较大、难以控制的药物分析。
血浆
将采集血液置含有抗凝剂的试管中，3000-4000r/min离心，取上清液即为血浆。
一般血浆中药物浓度高于血清，经采血后可立刻离心分离，低温保存；但血浆中蛋白含量较多，在SPE过程可能产生堵塞，其中抗凝物质可能干扰化合物检测。
血清
采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置15-30min，待其自然凝结后离心，取上清液即为血清。
血清较血浆相比少了大部分纤维蛋白，颜色较血浆更浅，干扰物质更少。
抗凝剂
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate, 99%, solubility ≥40.3 wt.% in H2O 乙二胺四乙酸二钾盐二水合物 | 25102-12-9 | 297408 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tripotassium salt dihydrate, 99% 乙二胺四乙酸三钾二水合物 | 65501-24-8 | 161689新 |
| Heparin sodium salt, 170 units/mg; M. W.: 15000-19000 肝素钠 | 9041-08-1 | 542858 |
| Heparin lithium salt, ≥150 units/mg, from porcine intestinal mucosa 肝素锂 | 9045-22-1 | 419651 |
| Calcium fluoride, 99% 氟化钙 | 7789-75-5 | 262002 |
| Potassium oxalate monohydrate, 98.5%, for bio 草酸钾一水合物 | 6487-48-5 | 180906 |
| Sodium citrate tribasic dihydrate, 99%, reagent grade 柠檬酸三钠盐二水合物 | 6132-04-3 | 482080 |
样品存储
采样后如需短期保存可4°C冷藏，长期保存则可-20°C冷冻，但需要避免反复冻融。可根据样品性质加入酶抑制剂、抗氧化剂等。
酶抑制剂
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| Sodium fluoride, 98%, analytical grade 氟化钠 | 7681-49-4 | 913010 危化品 |
| Physostigmine, 98% 毒扁豆碱 | 57-47-6 | 259510 |
抗氧化剂
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| L-Ascorbic acid, 99%, reagent grade 抗坏血酸 | 50-81-7 | 980479 |
| DL-α-Tocopherol, 96% DL-α-生育酚 | 10191-41-0 | 957498 |
样品前处理
蛋白沉淀1、有机溶剂沉淀法
使蛋白质的分子内及分子间氢键发生变化，适用于小分子化合物提取。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:1~3即可将90%以上的蛋白质去除，低温3500r/min离心10min便可使析出蛋白质完全沉淀。
常用有机溶剂
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| Acetonitrile, 99%, for analysis 乙腈 | 75-05-8 | 980995 危化品 |
| Methanol, 99.5%, for analysis 甲醇 | 67-56-1 | 949300新 危化品 |
| Ethanol, 99.7%, for analysis 乙醇 | 64-17-5 | 921327 危化品 |
| Tetrahydrofuran, 99%, for analysis 四氢呋喃 | 109-99-9 | 962213 危化品 |
当溶液pH低于蛋白质等电点时蛋白质会以阳离子形式存在，加入强酸可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。在酸性条件下分解的目标化合物不适用此法。
血清与强酸的比例为1:0.6左右混合，高速离心即可除去蛋白质。
常用强酸
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| Trichloroacetic acid, 99%, ACS reagent 三氯乙酸 | 76-03-9 | 519758 危化品 |
盐类可使溶液粒子强度发生变化，将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水沉淀。
血清与饱和硫酸铵的比例为1:2左右混合，离心10000r/min 1-2min即可除去90%以上蛋白质。
常用盐类
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| Ammonium sulfate, 99%, for analysis 硫酸铵 | 7783-20-2 | 946868 |
| Sodium sulfate, 99%, for analysis 硫酸钠 | 7757-82-6 | 953522 |
| Magnesium sulfate, 99%, anhydrous 硫酸镁 | 7487-88-9 | 998826新 |
| Sodium phosphate, 97%, anhydrous 磷酸钠 | 7601-54-9 | 997519 |
| Sodium citrate, 99%, reagent grade, anhydrous 柠檬酸钠 | 68-04-2 | 439754 |
利用目标化合物在两种不相溶液体间的分配系数差异提取目标化合物。
液液萃取法选择性高，可除去大部分杂质，对有机溶剂蒸发后复溶可以实现样品浓缩。 有机溶剂相和水相的体积比一般为1:1或2:1。
常用萃取溶剂
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| n-Hexane, 95%, HPLC/ACS 正己烷 | 110-54-3 | 133516 危化品 |
| Methyl tert-butyl ether, 99%, ACS/HPLC Certified 甲基叔丁基醚 | 1634-04-4 | 471256 危化品 |
| Ethyl acetate, 99%, for analysis 乙酸乙酯 | 141-78-6 | 966734 危化品 |
| 1-Butanol, 99.4%, ACS reagent 1-丁醇 | 71-36-3 | 984199 危化品 |
通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程实现对样品的分离、纯化和富集。
固相萃取法可以提高分析物的回收率，更有效地将分析物与干扰组分分离，操作简单、省时、省力。
相关产品
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| MCX SPE Cartridges, bed wt. 150 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack MCX 固相萃取小柱 | / | 905163 |
| MAX SPE Cartridges, bed wt. 150 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack MAX 固相萃取小柱 | / | 994507 |
| C18 SPE Cartridges, bed wt. 500 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack C18 固相萃取小柱 | / | 985532 |
| Al2O3－N SPE Cartridges, bed wt. 500 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack Al2O3-N 固相萃取小柱 | / | 2471238 |
| Al2O3－B SPE Cartridges, bed wt. 500 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack Al2O3-B 固相萃取小柱 | / | 926266 |
| Florisil SPE Cartridges, bed wt. 500 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack Florisil 固相萃取小柱 | / | 945557 |
| CN SPE Cartridges, bed wt. 500 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack CN 固相萃取小柱 | / | 939001 |
| NH2 SPE Cartridges, bed wt. 1 g, volume 6 ml, 30 pcs/pack NH2 固相萃取小柱 | / | 912171 |
SPME原理基于目标分析物在样品基质和涂层固定相之间的分配系数差异。当涂有固定相的探针暴露于样品中时，目标化合物会根据其在两相之间的分配系数从样品相转移到探针涂层中。萃取完成后，探针转移到分析仪器（如气相色谱或液相色谱）中进行热解析，从而释放并分析目标化合物。
SPME是一种快速、操作简单且绿色无溶剂的样品前处理技术。SPME探针可替代进样针直接进行气相色谱进样。
相关产品
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| SPME fibers (PDMS), 100 μm, 1 cm, metal alloy fiber, white hub plain, for use with manual holder 固相微萃取萃取头 聚二甲基硅氧烷(PDMS) | / | 9117003 |
| SPME fibers (CAR/PDMS), 75 μm, 1 cm, metal alloy fiber, black hub plain, for use with manual holder 固相微萃取萃取头 活性炭/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS) | / | 9117004 |
| SPME fibers (PDMS/DVB), 65 μm, 1 cm, metal alloy fiber, Purple hub plain, for use with manual holder 固相微萃取萃取头 聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(PDMS/DVB) | / | 9117005 |
| SPME fibers (DVB/CAR/PDMS), 50/30 μm, 1 cm, metal alloy fiber, red hub plain, for use with manual holder 固相微萃取萃取头 三层复合(DVB/CAR/PDMS) | / | 9117006 |
| SPME fibers (PA), 85 μm, 1 cm, metal alloy fiber, green hub plain, for use with manual holder 固相微萃取萃取头 聚丙烯酸酯(PA) | / | 9117007 |
| SPME fibers (PEG), 60μm, 1 cm, metal alloy fiber, purple hub plain, for use with manual holder 固相微萃取萃取头 聚乙烯醇(PEG) | / | 9117008 |
| SPME fibers (CW/DVB), 65μm, 1 cm, metal alloy fiber, blue hub plain, for use with manual holder 固相微萃取萃取头 聚乙二醇/二乙烯基苯(CW/DVB) | / | 9117009 |
SBSE的原理是将一个涂有固定相的小型磁力搅拌棒放入样品中，通过磁力搅拌使搅拌棒在样品中旋转，从而增加样品与固定相之间的接触面积和接触时间。目标分析物在样品基质和搅拌棒涂层之间达到分配平衡后，被吸附到搅拌棒的固定相上。萃取完成后，搅拌棒被取出并转移到分析仪器中进行热解析或溶剂解吸，以释放并分析目标化合物。
SBSE是继SPME后的又一项无溶剂萃取技术，易与自动化系统结合，实现高通量样品处理。
相关产品
| 品名 | CAS | 货号 |
|---|---|---|
| SBSE (PDMS), 10 mm × 0.5 mm, pack of 3 SBSE 吸取萃取搅拌棒 聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取涂层 | / | 983596 |
| SBSE (PDMS), 20 mm × 0.5 mm, pack of 3 SBSE 吸取萃取搅拌棒 聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取涂层 | / | 949251 |
| SBSE (ACAR/PDMS), 10 mm × 0.5mm, pack of 3 SBSE 吸取萃取搅拌棒 活性炭/聚二甲基硅氧烷(ACAR/PDMS)萃取涂层 | / | 961654 |
| SBSE (CAR/PDMS), 20 mm × 0.5 mm, pack of 3 SBSE 吸取萃取搅拌棒 活性炭/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取涂层 | / | 954842 |
| SBSE (PDMS/DVB), 20 mm × 0.5 mm, pack of 3 SBSE 吸取萃取搅拌棒 聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取涂层 | / | 927799 |
| SBSE (PDMS/DVB), 20 mm × 0.5 mm, pack of 3 SBSE 吸取萃取搅拌棒 聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取涂层 | / | 927799 |
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